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细菌的革兰染色

日期∶2014-9-30
 

 

革兰染色法由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立,是细菌学中很重要的鉴别染色法,因为通过此法染色,可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。

 一. 目的:

了解革兰氏染色法的原理,并熟悉操作步骤,了解细菌革兰染色的注意事项。


二. 实验原理:

微生物的细胞小且透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此,微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine )是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,而且将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液为番红。


三. 革兰染色实验所需材料

1. 菌种:大肠杆菌,枯草芽孢杆菌

2. 器材:显微镜,载玻片,染色缸等

3. 染色液:草酸铵结晶紫染色液,路哥氏(Lugol)碘液,95%乙醇,0.5%沙黄染色液


四. 实验步骤

1. 涂片: 将培养14-16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。

2. 染色:

(1) 初染: 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。

(2) 媒染: 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。

(3) 脱色: 将载玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒,立即用水冲净酒精。

(4) 复染: 用番红液染1—2分钟,水洗。

(5) 镜检: 干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。

(6) 同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。


革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。


五. 注意事项

1. 革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。

2. 选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜,若细菌太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

 




细菌革兰染色示意图1:



细菌革兰染色示意图2:



革兰染色阴性结果:红色(铜绿假单胞菌)


革兰染色阳性结果:紫色(炭疽芽胞杆菌)